结论

    本研究结果表明MicroFLOQ拭子对于困扰法医DNA案件工作的低拷贝以及降解样本有意义。传统方法中的提取步骤可能会导致样品污染和DNA损失。而直扩方法没有样品损失问题。因此可以获得更多完整以及信号更高的图谱。而且直扩方法只需要使用一小部分样品，可以保留珍贵的样品用于再次分析以及后续检验。

引言

        尼龙植绒拭子，例如4N6FLOQSwabs，可以最大化提高DNA样本的采集和释放效率。与传统的纤维棉签不同，植绒拭子以垂直的方式粘附在塑料杆的前端。因此，植绒拭子没有吸水芯，不会锁住样本，样本吸附在拭子头的表面，这样可以促进样本的释放和洗脱。研究已经证明DNA回收效率，植绒拭子优于传统的棉签。

       MicroFLOQ植绒拭子是新型的4N6FLOQSwabs，尼龙纤维排布方式与4N6FLOQSwabs相同，但使用裂解试剂处理，可以直接进行直扩。而且，因为MicroFLOQ拭子的头很小，仅需采集很少量的样本。而传统的棉签采集方法，需要繁琐的DNA纯化过程，而且可能会导致DNA损失，进而影响低拷贝样本的成功率。

      本文研究采用MicroFLOQ植绒拭子直扩血斑、唾液和接触DNA的效能。与传统方法相比，使用MicroFLOQ植绒拭子能否提高或改善法医案件工作效率。

材料与方法

血和唾液样本

      使用EDTA抗凝管采集人血，保存于4℃。用生理盐水将血稀释成10%，5%，1%。使用无菌管采集人唾液，并用去离子水稀释成10%，5%，1%。每个血稀释样本、纯唾液以及稀释唾液样本取10ul，滴到玻璃载玻片上，过夜干燥。

接触DNA样本

     从各种不同的表面提取接触DNA，包括：4个键盘、3个门把手、2个鼠标、2个手机、1个项链。

擦拭血斑、唾液斑和接触DNA

     按照“MicroFLOQ拭子潮湿或干燥样本采集方法”采集血斑、唾液斑和接触DNA。每个样本只采集少量样本。对照实验使用4N6FLOQSwabs采集尽可能多的样本。

DNA提取

     4N6FLOQSwabs采集的样本使用COPAN的NAO提篮和凯杰QIAamp DNA Investigator Kit试剂盒提取DNA。

DNA定量

     提取的DNA使用Quantifiler Human DNA Quantification试剂盒，ABI7500荧光定量PCR仪定量。

MicroFLOQ直扩拭子PCR扩增

     将MicroFLOQ拭子头折断到PCR管，使用GlobalFiler Express试剂盒扩增。使用9700PCR仪，扩增28个循环。

4N6FLOQSwabs提取DNA扩增

     使用GlobalFiler试剂盒扩增常染色体STR，Y-STRs和一个Y-indel。加入1ng DNA，样品量不足1ng，加入最大推荐量样本（15ul）。使用9700PCR仪，扩增29个循环。

结果与讨论

干燥MicroFLOQ拭子对比湿润的拭子

     血斑和唾液斑同时采用干燥和湿润的拭子采集。可能因为干燥拭子对样本回收效率低，只得到的少量的结果。使用湿润的拭子采集的样本信号明显改善。后续的实验均采用湿润的拭子采集样本。

化学处理的MicroFLOQ拭子抑制性评估

在有MicroFLOQ拭子的条件下扩增阳性对照DNA（007），所有的阳性对照都如预期一样得到了完整的STR图谱，表明化学处理的MicroFLOQ拭子并没有影响或抑制DNA扩增。

人血样本直扩

     使用MicroFLOQ拭子采集的30个10%稀释的血液样本，采集后立即进行扩增，结果只有7个得到了完整的STR图谱。最主要的原因是血液中存在抑制剂血红素。5%稀释的样本有28个得到了完整的STR图谱，而且图谱平衡度要好于10%稀释的样本。1%稀释的样本有29个得到完整图谱，但信号要低于5%稀释样本。

直扩血斑样本与传统方法（手工提取法）比较5% 和1%稀释的样本所有位点的信号都比传统的方法使用1ng DNA扩增的信号要高。

           图1：30个MicroFLOQ采集的5%稀释的血斑与4N6FLOQSwabs提取的1ng DNA平均信号

图2：30个MicroFLOQ采集的1%稀释的血斑与4N6FLOQSwabs提取的1ng DNA平均信号直扩唾液斑样本DNA

15个纯唾液样本，有14个得到了完整的STR图谱。所有10%稀释的唾液样本都得到了完整的图谱，并且信号强度要高于纯唾液样本。5%和1%稀释的样本也得到了完整的图谱，5%稀释样本信号要高于1%稀释样本。

直扩唾液样本与传统方法比较

    30个5%和1%稀释的样本与传统方法比较，所有样本，所有位点信号都高于传统方法。

             图3：30个MicroFLOQ采集的5%稀释的唾液与4N6FLOQSwabs提取的1ng DNA平均信号

            图4：30个MicroFLOQ采集的1%稀释的唾液与4N6FLOQSwabs提取的1ng DNA平均信号
直扩接触DNA

     4个键盘中有3个得到了不完整的、单一图谱，另外一个得到了完整的单一图谱。2个鼠标样本，其中一个得到完整单一图谱，另一个得到完整的混合图谱。3个门把手中有2个得到了不完整的单一图谱，另外一个得到3人混合的图谱。2部手机中，其中一部收集擦拭手握位置，得到完整图谱；另一部收集擦拭手握位置、拾音位置，听筒位置，结果只有手握位置得到完整图谱。项链样本得到了2个人的混合图谱。

结论

     本研究结果表明MicroFLOQ拭子对于困扰法医DNA案件工作的低拷贝以及降解样本有意义。传统方法中的提取步骤可能会导致样品污染和DNA损失。而直扩方法没有样品损失问题。因此可以获得更多完整以及信号更高的图谱。而且直扩方法只需要使用一小部分样品，可以保留珍贵的样品用于再次分析以及后续检验。