案件试剂盒研发过程中，我们发现，样本是扩增成功与否的关键因素。其中，我们将案件样本分为微量检材、降解检材、混合样本检材、抑制剂检材。

所谓微量检材，就是DNA含量少于 100 pg，相当于 15 个双倍体或 30 个单倍体细胞的生物样本。主要来源包括犯罪分子的衣着或穿戴物、作案使用的作案工具，可能会接触的一些生活用具。降解检材主要受到温度湿度以及微生物的分解作用等因素的影响，将会导致DNA片段分解，在检验中，出现基因信息的缺失。来自2个或2个以上个体的样本称为混合生物样本检材，由于个体在样本中所占的比例不同，因此不同样本的检出难易程度是不一致的。抑制剂检材是由于案件现场检材中污染物含量较多，抑制剂就相对常规检材多，例如陈年骨头，交通案件样本多为抑制样本。

那么，什么是抑制样本呢？

当干扰模板DNA和DNA taq聚合酶之间相互作用的杂质或化合物影响到PCR过程时，会发生PCR抑制。PCR抑制剂是导致PCR失败的最常见原因。PCR抑制剂会影响到PCR反应的每个步骤，根据抑制剂含量不同，抑制剂会导致数据丢失，图谱不完整，在极端情况下，扩增彻底失败会导致假阴性。同时，引起PCR抑制的物质多种多样，抑制物质的浓度会影响抑制的程度。

抑制是如何发生的呢？

PCR反应中许多步骤会发生抑制，抑制作用会影响到PCR反应中的各组分，包括模板DNA、核苷酸、引物、Mg2+和DNA聚合酶。但抑制剂的作用主要分为3类，包括阻碍DNA提取过程中的细胞溶解、核酸螯合或者降解和热启动DNA聚合酶失活。

其中，在某些浓度下，添加到样本提取步骤中的物质可能会引起抑制，这些物质包括盐类，sds等洗涤剂，以及EDTA、乙醇和苯酚等有机分子。腐殖酸等抑制剂会引起核酸的螯合或者降解，他的结构和DNA分子非常相似，在土壤中，游离DNA分子和腐殖酸结合，随着时间推移，腐殖酸会使DNA分子降解。抑制剂也会导致热稳定性DNA聚合酶失活。比如高浓度钙离子和单宁酸会减少或阻断DNA聚合酶的辅助因子，进而抑制DNA聚合酶的活性。血红蛋白、牛仔布中的靛蓝染料和毛发样本中的黑色素会与DNA TAQ聚合酶的活性部位结合，阻碍PCR扩增。

抑制样本类型有哪些？

抑制剂类型主要分为3类，PCR抑制剂可能存在于生物检材、基质与环境化合物，以及用于样本处理的耗材和试剂中。在法医DNA案件中，最常见的生物检材抑制剂是血液中的血红蛋白，最常见的基质抑制剂是牛仔布中的靛蓝染料。

同时，许多体液中都存在着会抑制PCR过程的生物检材。包括血液，阴道样本、口腔样本、粪便样本，骨骼，牙齿，精液，尿液和毛发。血液中可能存在的抑制剂，包括血红蛋白中的高铁血红素，胆汁和胆盐，免疫球蛋白和乳铁蛋白。红细胞中的血红蛋白，会在整个PCR反应过程中降低DNA聚合酶的活性还会导致自由荧光染料分子的淬灭。胆盐和胆红素也会抑制DNA聚合酶的活性。免疫球蛋白G会与单链基因组DNA结合，干扰引物退火和DNA聚合酶结合，这种情况发生在前几次PCR循环中，导致扩增被完全抑制。其次，白细胞中的乳铁蛋白会与核酸相互作用。细菌等微生物通常存在在阴道样本、粪便样本和口腔样本等生物样本中，细菌等微生物通过螯合或降解核酸进行相互作用。在PCR反应中，骨头，牙齿和食物中的钙可能会与镁离子竞争，使得镁不能作为DNA聚合酶的辅助因子。骨头中的胶原蛋白也会通过与阳离子结合来改变离子组成。在精液中，核糖体中含有精胺和亚精胺等多胺，他们通过与模板DNA结合来抑制PCR反应，从而阻止DNA聚合酶进入。尿液的主要成分是尿素，尿素通过降解DNA聚合酶来影响PCR反应。黑色素是存在在皮肤和毛发中的一种色素，通过与DNA聚合酶形成可逆复合物来抑制PCR反应。

样本基质和环境化合物也会有PCR抑制剂。一些纺织品或者织物含有深色或蓝色染料，如牛仔布中含有靛蓝染料，对PCR的抑制作用可能是对DNA聚合酶结合位点的直接干扰导致的。也可能是因为靛蓝染料在PCR反应中螯合镁离子，从而限制PCR反应中的镁离子这个重要辅助因子。单宁酸存在于皮革，也存在于一些植物基质和土壤中，单宁酸通过干扰DNA聚合酶来抑制PCR反应。腐殖酸存在于土壤中，还可能存在于埋葬的骨骼遗骸里，腐殖酸对PCR反应的抑制机制有多种，包括通过与模板DNA结合，和与酶螯合来猝灭荧光，抑制DNA聚合，干扰引物退火。同时，金属离子会降低引物的特异性，食品中的成分也会干扰PCR反应，例如，牛奶中蛋白酶会降解DNA聚合酶，钙和脂肪的干扰程度因浓度而异。此外，糖原，多糖，矿物质和酶也会影响PCR反应。

在DNA样本处理步骤中，也会发生PCR抑制。DNA提取试剂中使用的苯酚，chelex树脂、盐，磷酸盐缓冲液等都会使DNA聚合酶失活。在DNA提取试剂中加入抗凝血剂，通过与镁离子螯合使降解DNA的核酸酶失活。在PCR的下游分析过程中，edta会和镁螯合，从而去除DNA taq聚合酶中的镁离子，因此，需要适当使用edta，以免抑制扩增。肝素也是一种抗凝血剂，他会与模板DNA结合，从而直接抑制DNA聚合酶的功能。同时，在DNA分析中的任何步骤，DNA都会被吸收到PCR耗材中的塑料壁表面，这些会影响样本处理、DNA提取和扩增的效率。使用紫外线先处理PCR管和耗材时，释放的自由基会与DNA聚合酶发生负反应，进而影响PCR反应。彩色反应管和塑料器皿中的化学物质，也可能会渗出并干扰DNA扩增。经过实验测试，手套中的粉尘也会抑制PCR反应。

那么我们如何减少或去除抑制剂呢？

克服PCR抑制剂作用的方法有很多种，可以使用一种方法或者结合多种方法。其中，我们可以选择合适的采样技术，能够防止抑制剂与模板DNA共同提取的情况。例如，我们对已知含有抑制剂的基质来进行采样时，用拭子擦拭污渍代替剪掉污渍可以避免引入抑制剂。常用的方法是稀释DNA样本，从而稀释掉抑制物，然后再重新扩增样本，此时，样本中的抑制剂含量会减少，通常情况下，1比10 或者更大的稀释比例能够克服抑制剂的作用。但是，如果样本中的模板DNA量比较低，就会有其他的问题的产生。因为稀释样本会进一步减少可用于扩增的模板DNA量。也可以通过调整DNA提取方法去除PCR抑制剂。例如，有机提取法可以去除抑制性脂质，使用硫氰酸胍等离液盐DNA提取方法与磁珠提取法相结合，可以有效去除抑制剂。在扩增前对DNA样本进行纯化，也可以去除潜在的抑制剂。但是需要注意的是，这些操作可能会降低DNA的产量。